Cryopreservation of Ram Cauda Epididymal Spermatozoa Using Different Buffers and Sugar Combinations

The aim of this experiment was to study the effect of different sugars and buffers combinations in the extenders viz. Tris citric acid fructose (TCF), Tris citric acid glucose (TCG), Sodium citrate fructose (SCF) and Sodium citrate glucose (SCG) on the quality of Cauda epididymal spermatozoa of ram during cryopreservation and post thaw. Spermatozoa were recovered from Cauda epididymidis by incision method. Samples showing ≥70 % progressive sperm motility were pooled. Each pooled cauda epididymal sperm sample was divided into four aliquots and spermatozoa in each aliquot were washed using isotonic buffer by double centrifugation. Washed spermatozoa in each aliquot were extended separately in the four different extenders using 20% egg yolk and 8% glycerol as cryoprotectant. The quality of spermatozoa was evaluated immediately after extension in the particular extenders (pre-freeze) and at post thaw. The percent sperm motility was significantly (p<0.05) higher for TCF (45.00±4.47) than TCG (27.50±6.55) and SCG (20.83±5.39) extenders at post thaw. The percentage of HOST reacted spermatozoa was significantly higher (P<0.05) for TCF (61.05±2.60) than SCF (45.81±4.90) and SCG (46.41±4.16) at post thaw. The percent intact acrosome was also significantly higher (P<0.05) in TCF (79.39±2.16), SCF (80.74±1.38) and SCG (78.34±2.94) than TCG (71.32±2.47) at post thaw. In conclusion, the use of fructose as energy source in the Tris extender (TCF) was found the best combination of buffer and sugar for maintaining higher sperm quality during cryopreservation of ram caudaepididymal spermatozoa

Use of the ACP® and BTS extenders for cooling at 15°C white-lipped peccary (Tayassu pecari) semen / Uso dos diluidores ACP® e BTS para refrigeração a 15°C de sêmen de queixada (Tayassu pecari)

Knowledge about reproduction of white-lipped peccary is of great importance to assist with the conservation of this species and enable its rational use in captivity. This study aimed to evaluate the effect of ACP-103®, ACP-116® and BTS semen extenders on sperm viability during cooling of Tayassu pecari semen. Five ejaculates from four adult males were chilled. The animals were submitted to the protocols of sedation and anesthesia for semen collection by the electroejaculation method. After collection, the semen was macro- and microscopically assessed and diluted to reach 35x106 spermatozoa/mL in each of the three different extenders tested. The fresh-extended semen was packed in a BotuFLEX® thermal box to keep samples at 15°C for 24 hours. After cooling, the following semen parameters were analyzed: sperm motility, functional and structural integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, chromatin condensation, and the thermoresistance test was performed. The parameters sperm motility, structural and functional integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, and chromatin condensation were preserved after use of the extenders tested, and were similar to those of in natura semen (p>0.05). Curvilinear velocity (VCL) (p<0.05) was the only parameter with reduced values after cooling regardless of the extender used. The percentage of sperm with normal morphology was greater in samples cooled using the BTS extender (p<0.05). The ACP-103®, ACP-116® and BTS extenders can be used for the cooling and preservation of white-lipped peccary semen at 15°C for 24 hours.(AU)

Para auxiliar na conservação da espécie e permitir o uso racional do queixada em cativeiro é de grande importância o conhecimento sobre a reprodução da espécie. Objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores de sêmen ACP-103®, ACP-116® e BTS na viabilidade espermática durante a refrigeração do sêmen do Tayassu pecari. Foram refrigerados cinco ejaculados provenientes de quatro machos adultos. Os animais foram contidos com auxílio de puçá e submetidos ao protocolo de sedação e anestesia para realização da coleta de sêmen pelo método da eletroejaculação. Depois da coleta, o sêmen foi avaliado macro e microscopicamente e diluído para atingir 35x106 espermatozoides/mL em cada um dos três diferentes diluidores testados. O sêmen diluído foi acondicionado em caixa térmica BotuFLEX® para manter as amostras a 15°C por um período de 24 horas. Depois da refrigeração, os espermatozoides foram avaliados quanto aos parâmetros de movimento espermático, integridade funcional e estrutural das membranas espermáticas, atividade mitocondrial, condensação da cromatina e teste de termorresistência. Os diluidores testados preservaram as características cinéticas, a integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas, a atividade mitocondrial e a condensação da cromatina semelhante ao sêmen in natura (P>0,05). O único parâmetro que reduziu com o processo de refrigeração independente do diluidor utilizado foi a Velocidade Curvilinear (VCL) (P<0,05). Foi observado aumento do percentual de espermatozoides morfologicamente normais nas amostras refrigeradas em BTS (P<0,05). Os diluidores ACP-103®, ACP-116® e BTS podem refrigerar e conservar o sêmen de queixada a 15°C por 24 horas.(AU)

Refrigeração do sêmen da garoupa-verdadeira Epinephelus marginatus / Refrigerated storage of dusky grouper Epinephelus marginatus sperm

Foram estudados diferentes diluentes no processo de refrigeração do sêmen da garoupa-verdadeira. Inicialmente, a taxa e a duração da motilidade e a concentração espermática foram avaliadas, caracterizando a qualidade do sêmen fresco. Para os testes de refrigeração a 4ºC, diferentes diluentes foram testados em atmosfera normal e modificada (100% oxigênio). O sêmen fresco apresentou concentração espermática de 3,1±0,2 x 109 células mL-1, motilidade média de 90%, permanecendo móvel, em média, por 3.060 segundos. No experimento de refrigeração, a taxa e a duração média da motilidade foram mantidas adequadas durante 144 horas para o diluente A (70%; 3100 segundos) em atmosfera normal. Na atmosfera modificada, a qualidade do sêmen caiu drasticamente durante as primeiras 24 horas, independentemente do diluente empregado, não propiciando vantagem em sua utilização. A refrigeração do sêmen da garoupa-verdadeira permite manter por até 144 horas uma apropriada qualidade espermática.(AU)

This study aimed to evaluate different extenders in refrigerated storage of dusky grouper sperm. Initially, motility rate, motility time, and sperm density were analyzed to characterize the fresh sperm quality. Different diluents were used in the refrigerated storage sperm at 4ºC in normal atmosphere and modified atmosphere (100% oxygen). The fresh sperm has a spermatozoa density of 3.1±0.2 x 109 spermatozoa mL-1, motility rate 90% and motility time of 3,060 seconds. In the experiment of refrigerated storage, the motility rate and the motility time were maintained appropriate for 144 hours for the extender A (70%; 3,100 seconds) in normal atmosphere. In the modified atmosphere, the sperm quality decreased drastically during the first 24 hours, independently of the diluent used, not propitiating advantages. The refrigerated sperm of dusky grouper is a viable alternative for the short-term storage, being possible, to maintain for up to 144 hours an appropriate sperm viability.(AU)

Viabilidade do sêmen de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) centrifugado e diluído em Tris ou agua de coco em pó / Viability of the six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) semen centrifuged and extended in Tris or powdered coconut water

Foram avaliados os efeitos da centrifugação associada ao uso de dois diluentes na manutenção da viabilidade espermática em tatus-peba (Euphractus sexcinctus) ao longo do teste de termorresistência (TTR). Amostras de sêmen (n=12), oriundas de 04 machos adultos coletados por eletroejaculação, foram divididas em quatro alíquotas, sendo duas imediatamente diluídas em Tris ou água de coco em pó (ACP-119(r)), e as outras duas centrifugadas (800g10min-1) previamente à diluição. As amostras foram incubadas a 34°C por 3h, e os parâmetros seminais avaliados em intervalos de 1h. Em termos gerais, verificou-se uma redução da viscosidade espermática imediata à diluição em ambos os diluentes, independente do uso da centrifugação. Aos 60 minutos, verificou-se uma redução dos parâmetros avaliados (P<0,05), embora o Tris tenha promovido uma melhor preservação deles (P<0,05), quando comparado ao ACP-119(r) até os 120 minutos de avaliação. Após este período, os dois diluentes se equipararam (P>0,05). Ainda, verificou-se um efeito deletério da centrifugação sobre a qualidade do sêmen de tatus-peba durante todo o teste de termorresistência. Nas condições do presente estudo, conclui-se que o diluente Tris mostrou-se superior ao ACP-119(r) para a manutenção da viabilidade do sêmen de tatus-peba, sendo desnecessária a realização de centrifugação prévia à diluição.

The effects of the centrifugation associated to the use of two extenders on the viability of six-banded armadillo's (Euphractus sexcinctus) sperm were evaluated during a thermo resistance test (TRT). Semen samples (n=12) derived from 04 stud males collected by electroejaculation were divided in four aliquots; two of that were immediately diluted in Tris or powdered coconut water (ACP-119(r)); the two others were centrifuged (800g10min-1) prior to the dilution. Samples were incubated at 34ºC per 3h, and the semen parameters were evaluated at each hour. In general, dilution promoted a reduction in semen viscosity in the use of both diluents using centrifugation or not. At 60min, a decrease was verified for all semen parameters (P<0.05), however they were better preserved in the use of Tris when compared to ACP-119(r) (P<0.05) up to 120min. After that, both diluents equated. In addition, centrifugation procedure presented a deleterious effect on the armadillo's semen quality during all the thermoresistance test. In the present conditions, conclude that Tris extender is more efficient than ACP-119(r) for the preservation of six-banded armadillo semen viability, and the previous centrifugation is unnecessary.

Efeito da centrifugação sobre a qualidade do sêmen canino / Effect of centrifugation on quality of canine semen

Avaliou-se o efeito da centrifugação sobre a viabilidade do sêmen canino e compararam-se três meios de diluição pré-centrifugação. Utilizaram-se 10 ejaculados completos de 10 cães que, após a avaliação inicial, foram divididos em quatro porções (grupos). Uma das amostras, não centrifugada, formou o grupo-controle; as outras foram diluídas em três diferentes meios e centrifugadas a 800 x g por 15 minutos, formando os grupos: CPSA - constituído por sêmen centrifugado em plasma seminal autólogo; CLG - sêmen centrifugado em meio à base de leite desnatado e glicose (LG); e CPer- sêmen centrifugado em gradientes de Percoll (45 por cento e 90 por cento). Após a centrifugação e a eliminação do sobrenadante, procedeu-se à ressuspensão de todas as porções do ejaculado em LG e à imediata avaliação quanto à motilidade, vigor, aglutinação espermática e integridade das membranas espermáticas. Todas as suspensões foram, então, incubadas a 37ºC por 30 minutos e reavaliadas. O processo de centrifugação não causou danos aos espermatozoides e a centrifugação em meio LG melhorou a viabilidade espermática.

The effect of the centrifugation process on canine sperm viability was evaluated using three different precentrifugation extenders in the process. After an initial evaluation, ten complete ejaculates from ten dogs were used and subdivided in four groups. One sample of semen was not centrifuged and was used as control and the remaining samples of semen were diluted in three different extenders and centrifuged at 800 x g per 15 minutes, performing groups: CPSA- centrifuged in autologous seminal fluid, CLGcentrifuged in skim milk plus glucose extender (LG), and CPer- centrifuged under Percoll gradient (45 percent and 90 percent). After centrifugation, the resulting pellets were diluted in LG and evaluated for motility, viability, sperm agglutination, and spermatic membrane integrity. All the samples were incubated at 37ºC for 30 minutes and the evaluations were performed again. Centrifugation procedures did not induce damage to canine spermatozoa and samples centrifuged and diluted in skim milk plus glucose extender remained with better viability.

Sucesso do resfriamento e congelamento de sêmen de pirapitinga Brycon nattereri / Sucess of cooling and freezing of pirapitinga (Brycon nattereri) semen

Avaliaram-se protocolos de resfriamento e de criopreservação do sêmen de pirapitinga (Brycon nattereri) utilizando-se sêmen diluído em NaCl 154mM, NaCl 200mM, Saad e BTS® e resfriado por sete dias. Cinco diluidores (glicose 277mM, NaCl 154mM, NaCl 200mM, Saad e BTS®) foram combinados com dois crioprotetores (DMSO - dimetilsulfóxido e metilglicol) e usados como meio de congelamento. O sêmen diluído em cada meio foi envasado (palhetas de 0,5ml) e congelado, e a motilidade espermática avaliada após o descongelamento (60ºC, 8seg). O sêmen foi novamente congelado em palhetas com diferentes volumes (0,25 e 0,5ml) e descongelados em banho-maria em duas temperaturas (50º e 60ºC). As maiores motilidades (48 por cento) foram observadas no sêmen diluído em BTS® e resfriado por sete dias. Motilidade espermática acima de 68 por cento foram observadas no sêmen congelado em NaCl 154mM-metilglicol, BTS®-metilglicol, NaCl 200mM-DMSO e Saad-DMSO. Não houve diferença entre os volumes de palheta nem entre as temperaturas de descongelamento quanto a motilidade espermática. Assim, o sêmen de pirapitinga mantém altas taxas de motilidade quando resfriado em BTS® por até sete dias ou congelado em NaCl 154mM-metilglicol, BTS®-metilglicol, NaCl 200mM-DMSO e Saad-DMSO

Cooling and freezing protocols of pirapitinga (Brycon nattereri) semen were evaluated using semen diluted in 154mM NaCl, 200mM NaCl, Saad or BTSÕ, and cooled for seven days. Sperm motility was daily evaluated. Five extenders (277mM glucose, 154mM NaCl, 200mM NaCl, Saad and BTSÕ) were combined with two cryoprotectants (DMSO - dimethyl sulphoxide and methylglycol) to produce 10 cryosolutions. Semen was diluted in each cryosolutions, aspirated into 0.5ml straws and frozen. Sperm motility was evaluated after thawing (60ºC, 8 sec). Then, semen was frozen in straws with different volumes (0.25 and 0.5ml), and thawed under different water-bath temperatures (50º and 60ºC). Higher sperm motility (48 percent) was observed when semen was cooled in BTSÕ for seven days. Post-thawing sperm motility above 68 percent was observed when semen was frozen in 154mM NaCl-methylglycol, BTSÕ-methylglycol, 200mM NaCl-DMSO or Saad-DMSO. There was no difference on sperm motility when semen was frozen in 0.25 or 0.5ml straws and thawed in 50º or 60ºC water-bath. Thus, pirapitinga semen can be successfully cooled in BTSÕ for seven days or frozen in 154 mM NaCl-methylglycol, BTSÕ- methylglycol, 200mM NaCl-DMSO and Saad-DMSO

Efeito da concentração e temperatura de adição de trealose em diluentes para a congelação de sêmen ovino em palhetas / Effect of the concentration and addition temperature of trehalose in extenders on freezing ram semen in straws

A trealose é um dissacarídio com potencial emprego como crioprotetor quando adicionada aos meios para congelamento de sêmen ovino. Este experimento foi realizado para verificar os efeitos da temperatura de adição (30°C e 4°C) e da concentração de trealose (2 por cento, 4 por cento e 6 por cento) sobre o sêmen ovino congelado em palhetas, utilizando como base as formulações INRA e TRIS/FRUTOSE. Os efeitos estudados em ambos experimentos foram medidos através da avaliação da motilidade espermática (MOT) e da integridade de acrossomas (INTA) em diferentes momentos após o descongelamento (0h, 2h e 5h). Os presentes resultados não recomendam a inclusão da trealose visando incrementar a qualidade in vitro do sêmen ovino congelado em palhetas nas concentrações e diluentes testados, porém, sugerem maiores estudos quanto a sua toxidade e possíveis interações com outros constituintes dos diluentes já formulados para o congelamento de sêmen ovino.

This study was aimed to evaluate the possible effects of the addition of trehalose to extenders developed for freezing ram semen in straws. The effects of addition temperature (30°C and 4°C) and concentration of trehalose (2, 4 and 6 percent) on INRA and TRIS/FRUTOSE diluents was evaluated. Their effects were studied through motility rate and by acrosome integrity at different incubation times after thawing (0, 2 and 5h). The results do not recommend the inclusion of trehalose in these diluents. However, it would be interesting to learn more about toxicity and interactions between the components of the extenders and trehalose in ram sperm frozen in straws.